Bakterie jako indikátory aneb úskalí mikrobiologického rozboru vody
Pokud provádíme rutinní mikrobiologický rozbor vody, není v našich silách stanovit všechny potenciálně patogenní bakterie, které se v ní nalézají. Právě proto byl stanoven koncept indikátorových bakterií. Ty lze rozdělit na dvě skupiny, a to indikátory organického a indikátory fekálního znečištění.
- Pár slov na úvod o metodách a kultivaci
- Indikátory organického znečištění
- Indikátory fekálního znečištění
- Možné problémy
Pár slov na úvod o metodách a kultivaci
Co je to kultivace a proč se jí vůbec zabývat? Pod záhadně znějícím termínem se laicky řečeno neskrývá nic jiného namnožení mikroorganismů na živném médiu. Kultivace je základním postupem sloužícím k přímému důkazu bakterií. To, jaký mají bakterie charakter růstu, je totiž důležité pro jejich vlastní identifikaci. Kolonie bakteriálního druhu, přesněji řečeno jejich tvar či barva se totiž řadí mezi základní taxonomické znaky. Bakterie se kultivují (neboli jednoduše řečeno množí) na sterilních živných médiích, které musí poskytnout mikroorganismům dostatek živin a vody.
Pro porozumění dalšímu textu pro nás bude nejdůležitější vědět, že existují média syntetická s přesně definovaným složením (ústojné roztoky, zdrojem uhlíku obvykle glukóza, zdrojem dusíku (NH4)2SO4nebo NH4Cl, čisté aminokyseliny, vitamíny a růstové faktory) a média přirozená (komplexní), u kterých přesně definované složení zajistit nemůžeme (mají ve svém základu živný bujón a nejsou chemicky definované).
Jsou tvořeny složkami získanými po kyselé hydrolýze kaseinu, želatiny nebo po enzymatické hydrolýze masa (pepsin, trypsin, pankreatin).
Dále pro nás budou důležitá univerzální média a selektivní média. Univerzální média (neselektivní média) jsou schopná vyživovat velké množství organismů, zatímco selektivní média zajistí optimální podmínky pro růst jen určité skupině bakterií, například bakterie schopné fixace vzdušného dusíku.
Speciálním případem jsou pak selektivně diagnostická média, která umožňují růst jen velmi malé skupině bakterií a navíc obsahují indikátorovou složku, která změní barvu, když dojde k charakteristickému růstu bakterií (případně může docházet ke změně barvy kolonie).
Indikátory organického znečištění
Tato skupina je z hygienického hlediska méně významná a nutno dodat, že v podstatě uměle vytvořená. Patří sem vybraní zástupci bakterií, kvasinek a plísní schopných za přesně dané teploty na neselektivních médiích bez inhibičního účinku selektivních činidel. Jedná se většinou o tzv. původní (neboli autochtonní) vodní mikroorganismy a mikroorganismy pocházející z půdy či z kořenových systémů rostlin.
Přítomnost těchto bakterií ve vodě je odrazem jejích celkového mikrobiálního oživení. Stanovené množství bakterií je pak známkou toho, jak je vodní zdroj znečištěn ve vodě snadno rozložitelnými organickými látkami.
Problémem ale může být to, že vzhledem k tomu, že pro tak širokou skupinu mikroorganismů nelze zajistit vhodné kultivační podmínky, jsme schopni detekovat jen malý podíl z těch skutečně obsažených ve vodě.
Zatímco z hygienického hlediska není tato skupina tolik významná, stanovení životaschopných bakterií může být velmi užitečné z hlediska následného procesu jako je úprava vody.
Při mikrobiologickém rozboru se pak pozornost soustředí na bakterie s růstovým optimem mezi 20 až 37 ˚C schopné růst na definovaných neselektivních médiích. Patří sem například zástupci rodu Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Flavobacterium, Agrobacterium, Xanthomonas, Salmonella, Escherichia, Rhizobium, enterokoků či vibrií.
V anglicky psané literatuře se pro tuto skupiny vžilo označení HPC (z výrazu heterotrofic plate count). Zahrnuje tři velké skupiny bakterií; a to kultivovatelné organismy, psychrofilní bakterie a mezofilní bakterie.
Kultivovatelné mikroorganismy
Stanovení těchto mikroorganismů je v současnosti na rozdíl od následujících dvou skupin vyžadováno českou legislativou. Jedná se konkrétně o vyhlášky vyhl. 252/2004 Sb., ve znění pozdějších předpisů, 187/2005 Sb., 293/2006 Sb., 70/2018 Sb., upravující stanovení jakosti pitných vod, vyhl. 275/2004 Sb., upravující stanovení jakosti balení vod a konečně i vyhl. 135/2004 Sb., ve znění pozdějších předpisů (292/2006 Sb., č. 238/2011 Sb.); týkají se stanovení jakosti vody na koupalištích.
Indikátorové bakterie, kvasinky a plísně zařazené do této skupiny se nejlépe množí při 20 až 36 ˚C. Pro jejich kultivaci se používá tryptonový agar s kvasničným extraktem a kolonie začnou vznikat po 2 až 3 dnech inkubace
Psychrofilní bakterie
Tyto bakterie mají růstové optimum kolem 20 ˚C a pro jejich kultivaci se používá masopeptonový agar. Tvoří kolonie s inkubační dobou 3 dny. Jejich stanovení v pitných a koupacích vodách česká legislativa vyžadovala do roku 2004.
Mezofilní bakterie
Tyto bakterie mají růstové optimum kolem 37 °C, doba inkubace je podobný jako v předchozích případech, kolonie začnou tvořit po 2 dnech. Podobně jako v případě psychrofilních bakterií bylo jejich stanovení standardem v pitných a koupacích vodách až do roku 2004. V současnosti ale legislativa jejich stanovení v žádném typu vod nevyžaduje.
Indikátory fekálního znečištění
Mezi indikátory fekálního znečištění patří hlavně bakterie, jejichž přítomnost ve vodě může signalizovat kontaminaci střevními patogeny – například salmonelly, shigelly, patogenní sérovary či patogenní kmeny Escherichia coli. Ideální bakterie sloužící jako indikátor fekálního znečištění by především neměla být patogenní.
Dále by se měla ve velkém počtu vyskytovat v exkrementech teplokrevných živočichů (bavíme se tedy převážně o savcích), nemnožit se ve vodě, ale zároveň v ní přetrvávat tak dlouho jako patogenní bakterie. S nimi by měla mí společnou i odolnost k dezinfekčním činidlům a okolnímu prostředí. Pro analýzu je též žádoucí, aby byla snadno stanovitelná.
Stojí za to zvýraznit, že tato kritéria plně nesplňuje žádná z bakterií, která se dnes jako indikátor fekálního znečištění používá.
Nejčastěji se využívají bakterie Escherichia coli, termotolerantní koliformní bakterie; dále intestinální enterokoky, koliformní bakterie a Clostridium perfringes. Poslední dvě jmenované jsou využívány spíše pro posouzené účinnosti procesů používaných při úpravách pitné vody.
Vhodnost a spolehlivost používání fekálních indikátorů je dlouhodobě předmětem odborných diskuzí. Co se týče české legislativy ta mezi fekální indikátory řadí koliformní bakterie, termotolerantní (fekální) koliformní bakterie, Escherichia coli, intestinální enterokoky, a Clostridium perfringes.
Koliformní bakterie
Koliformní bakterie jsou gramnegativní tyčinky, které netvoří spóry, mají negativní cytochromoxidázový test a za aerobních podmínek tvoři kolonie během 24 h kultivace při 36±2 °C na selektivním diferenciačním médiu s laktózou za současné tvorby kyselin nebo aldehydů (TNV 75 7837).
Definice koliformních bakterii podle ČSN EN ISO 9308–1 je velmi podobná. Jednoduše řečeno se jedná o bakterie ve tvaru tyček, a aby mohly úspěšně tvořit kolonie potřebují k tomu aerobní podmínky tedy nedokážou přežít bez kyslíku. Kolonie tvoří při teplotě 37 °C na selektivním kultivačním médiu s obsahem laktózy, ze které tvoří kyseliny či aldehydy. Netvoří spory, jsou gramnegativní (tedy v posledním kroku Gramova barvení budou růžové) a mají negativní cytochromoxidázový test. Původně se do této skupiny zařazovaly jen bakterie rodu Escherichia, Citrobacter, Klepsiella a Enterobacter.
Jak se měnila definice koliformních bakterií, začala se tato skupina rozšiřovati o další rody například Serratia, Hafnia nebo Rahnella. Dnes používaná definice pochází z roku 1994. Uvažuje se ale o další změně jejího znění. Můžou za to hlavně analytické metody používané pro stanovení koliformních bakterií. Ty jsou totiž založené na stanoven aktivity β-D-galaktosidázy – enzymu, který jako první štěpí laktózu.
Pokud budeme stanovovat koliformní bakterie na základě aktivity tohoto enzymu, zařadíme do této skupiny větší počet bakterií, než pokud bychom se soustředili jen na konečné produkty využití laktózy. Stanovení koliformních bakterií je stále požadováno v případě povrchových vod dle Nařízení vlády 229/2007, pitných vod dle vyhlášek 252/2004 Sb.; ve znění pozdějších předpisů, balených vod dle vyhlášky 275/2004 Sb. a též vod koupacích dle vyhlášek135/2004 Sb.; ve znění pozdějších předpisů.
Termotolerantní koliformní bakterie
Definice těchto bakterií je až na jeden ukazatel shodná jako v případě koliformních bakterií. Konkrétně se jedná o teplotu, při které bakterie tvoří kolonie, v případě termotolerantních bakterií mluvíme o hodnotě 44 ˚C.
Jde o gramnegativní tyčinky netvořící spory, s negativním cytochromoxidázovým testem, které tvoři za aerobních podmínek kolonie během 24 h kultivace při 44 °C na selektivním diferenciačním médiu s laktózou za současné tvorby kyselin nebo aldehydů (TNV 75 7835).
Do této skupiny patří bakterie rodu Escherichia, Citrobacter, Klepsiella či Enterobacter. Bylo ovšem zjištěno, že původem těchto mikroorganismů nemusí být vždy trávicí trakt, ale např. průmyslové vody, rozkládající se rostlinný materiál, půda apod. Používají se pro zhodnocení kvality pitné vody a též jako indikátor účinnosti dezinfekce vody. Česká legislativa požaduje jejich stanovení v povrchových vodách dle nařízení vlády 229/2007 podle normy ČSN 75 7221/98 a ve vodách na koupalištích dle vyhlášek 135/2004 Sb., ve znění pozdějších předpisů.
Escherichia coli
Podle normy ČSN EN ISO 9308–1 jsou bakterie rodu E. coli definovány jako koliformní bakterie, které produkuji indol z tryptofanu. Norma TNV 75 7835 je popisuje jako termotolerantní koliformní bakterie, které mají schopnost hydrolyzovat specifickým enzymem b-D-glukuronidazou 4-methyl-umbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) za vzniku 4-methyl-umbelliferonu; ten vykazuje modrou fluorescenci v UV světle.
E. coli je považována za nejvhodnější indikátor čerstvého fekálního znečištěni, a to i přesto, že bylo prokázáno, že se může pomnožovat ve vodě a v tropických půdách. Její stanovení je českou legislativou vyžadováno v povrchových vodách (NV 229/2007), pitných vodách (vyhl. 252/2004 Sb., ve znění pozdějších předpisů), balených vodách (vyhl. 275/2004 Sb.) a koupalištích (vyhl. 135/2004 Sb., ve znění pozdějších předpisů).
Možné problémy
Již bylo zmíněno, že žádná bakterie používaná jako indikátor fekálního znečištění není pro tyto účely ideální. Co se týče koliformních bakterií, problémem je, že tato skupina dnes zahrnuje nejen fekální ale i environmentální druhy. Podobně je tomu v případě termotolerantních bakterií, protože jak již bylo zmíněno, tyto bakterie mohou pocházet i z průmyslových vod, z rozkládajícího se rostlinného materiálu nebo z půdy.
Vhodnost indikátorových bakterií je tak zvláště v posledních letech neustále zpochybňována. Například se objevily studie poukazující na to, že kdyby byly jako indikátory fekální znečištění mořské vody využívány intestinální enterokoky, vedlo by to pravděpodobně k častějším uzavírkám mnohých rekreačních oblastí. Množství enterokoků totiž mnohonásobně překračovaly hygienické limity ve více případech, než tomu bylo při stanovení koliformních či termotolerantních bakterií.
Obchodní manažer
Literatura
- Bakterie ve vodách a jejich rozdělení. Dostupné online: https://is.muni.cz/th/22808/prif_d/1_UVOD.pdf, [cit. 20.3. 2023]
- Informační systém infekčních nemocí (ISIN)
- TŮMA, I: Mikrobiologie pro zahradnické obory Díl 2. Ekologie mikroorganismů: Dostupné online: https://web2.mendelu.cz/af_291_projekty/files/23/23-mikrobiologie_(pro_zahradnicke_obory)_dil_2._ekologie_mikroorganismu_tuma.pdf, cit [25.3.2023]
- Skripta ke cvičení z obecné mikrobiologie, cytologie a morfologie bakterií. Dostupné online: https://is.muni.cz/do/rect/el/estud/prif/js17/cviceni_mikrobiologie/web/pages/kultivace_mikroorganizmu.html, [cit. 27.3. 2023]